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在生物制品的生產(chǎn)過程中,宿主細胞DNA可能會殘留其中,這將會導(dǎo)致致癌基因或其他風(fēng)險的遺傳物質(zhì)進入到最終的藥物制劑中。為了降低這種風(fēng)險,監(jiān)管機構(gòu)規(guī)定了允許殘留的HCD限度,根據(jù)所使用的細胞系及給藥方案的不同,允許的HCD殘留范圍在10~100pg/劑量之間。關(guān)于HCD殘留的檢測,《中國藥典2020》中列出了三種方法,分別是DNA探針雜交法、熒光染色法,以及定量PCR法。而USP General Chapter <509>“Residual DNA Testing”章節(jié)中建議使用基于探針的DNA定量作為驗證方法,用于檢測在大腸桿菌(E. coli)或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系中生產(chǎn)的重組生物制品,以確保更好的靈敏度和準確性。在整個生產(chǎn)過程中,質(zhì)控人員需要對DNA水平進行評估,這些樣本可能含有其他雜質(zhì)和高濃度的藥物活性成分,因此必需一種可靠且靈敏的DNA定量方法。
Cygnus Technologies新推出的AccuRes?系列DNA定量試劑盒,專為用CHO、人或E. coli 細胞系重組表達生產(chǎn)的生物制品中HCD殘留檢測而設(shè)計。高濃度樣品可通過最小程度的稀釋后進行檢測,從而有效降低檢測限(LOD)。
Cygnus AccuRes?系列HCD檢測試劑盒的優(yōu)勢特點:
? 準確性—探針法qPCR保證了針對目標細胞系(如CHO, HEK,E. coli 等)HCD檢測的特異性,避免目標HCD的漏檢;
? 更好的精確度—CleanAmp® dNTPs與熱啟動Taq DNA聚合酶體系可有效降低PCR擴增過程中的非特異性啟動;
? 靈活性—兼容所有能檢測FAM熒光信號的qPCR設(shè)備,降低額外購置設(shè)備的成本
? All-in-one kit支持從樣品到qPCR的全過程—試劑盒中包含了DNA提取試劑(試管法或孔板法),AccuRes? PCR體系預(yù)混液,引物/探針預(yù)混液和DNA標準品
? 靈敏度—LOD為0.6 fg/μl。
Cygnus AccuRes?系列HCD檢測試劑盒操作流程
- DNA提取
Cygnus的DNA提取方法采用了一種新型DNA carrier,能夠從痕量水平的殘留DNA中回收HCD,并在無蛋白質(zhì)、鹽和洗滌劑污染的環(huán)境中進行DNA檢測和定量。這比其他提取方法提高了DNA檢測和擴增的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。
- 擴增
Cygnus AccuRes? 系列試劑盒中采用高特異性引物/探針體系對目標HCD進行擴增。帶有FAM熒光標記的核酸探針在每一次PCR反應(yīng)循環(huán)中被BHQ-1? 淬滅。先進的 CleanAmp® dNTPs與熱啟動Taq DNA聚合酶反應(yīng)體系降低了非特異性擴增,進一步確保了qPCR擴增的特異性,靈敏度與穩(wěn)定性,同時qPCR體系的配置可以在室溫條件下操作。
- 定量
試劑盒標準品的ct值構(gòu)建的標準曲線可將檢測結(jié)果計算為pg/10μl宿主細胞殘留DNA,進而可將HCD濃度換算為ng/mL, ng/mg或是ng/劑量?;谠摲椒?,殘留DNA最低可定量的濃度為0.6 fg/μL。
Cygnus AccuRes?系列HCD檢測試劑盒測試數(shù)據(jù)
準確性與可重復(fù)性測試。由兩名操作員(A和B)分別在兩天內(nèi)對已知DNA樣本進行兩次檢測,計算檢測結(jié)果的SD, CV和回收率%(見下表)。
完整的和不同程度降解的CHO DNA的提取與擴增效果對比。將完整的gDNA(Control)與分別用Alu1酶處理30min、1h、1.5h和2h后的DNA(Digested)凝膠電泳圖像。對照組和酶處理30min組樣品擴增的線性范圍基本一致(如下圖)。
存在外源DNA的情況下,CHO引物/探針仍具有廣泛的線性范圍和特異性。不同濃度的E. coli DNA不會影響CHO DNA的標準曲線(如下圖)。
過程樣品與藥物原液(DS)檢測結(jié)果對比。對比含有1 mg/mL陰離子交換或陽離子交換純化的蛋白樣品或藥物蛋白的CHO DNA回收率(見下表)。
Cygnus AccuRes?系列HCD檢測試劑盒訂購信息
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
CHO AccuRes? DNA Quantification Kit in Tubes |
D1555T |
1 kit |
CHO AccuRes? DNA Quantification Kit in Wells |
D1555W |
1 kit |
Human AccuRes? DNA Quantification Kit in Tubes |
D1160T |
1 kit |
Human AccuRes? DNA Quantification Kit in Wells |
D1160W |
1 kit |
E. coli AccuRes? DNA Quantification Kit in Tubes |
D1415T |
1 kit |
E. coli AccuRes? DNA Quantification Kit in Wells |
D1415W |
1 kit |
Cygnus Technologies, LLC.為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法,旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒,用于檢測超過50種不同表達系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測的高靈敏度分析技術(shù)的專家,Cygnus的產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被幾乎所有主要的生物制藥公司使用超過25年。
北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理,與國內(nèi)眾多知名藥企,CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段,提高藥物質(zhì)量、純度和安全,加速優(yōu)化研發(fā)工藝,減少產(chǎn)品上市時間,降低QC成本。如您對上述產(chǎn)品感興趣,歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.bgpj.com.cn了解更多信息。